两种方法提取RNA 超微量光度计进行浓度测定

本研究通过不同总RNA提取方法及不同反转录引物得到的cDNA进行环状RNA扩增，同时用超微量光度计进行浓度测定，进一步寻找可靠、省时、高效的环状RNA扩增手段。

miRNeasy Mini试剂盒提取总RNA

根据miRNesay Mini Kits(Qiagen)操作手册进行。具体如下，向1×107个Hep2细胞中加入1mLQIAzol裂解液，室温放置5min，加入200μL氯仿剧烈震荡15s，室温静置2~3min，4℃12000g离心15min，将上层清液转移到一个新的EP管中，加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀。吸取700μL样本转移到miRNeasy Mini柱内，室温8000g离心15s，弃掉收集管中的液体。向离心柱内加入700μL的BufferRWT，8000g离心，15s，弃滤液。吸取500μL的BufferRPE于离心柱内，8000g离心15s，弃滤液。吸取500μL的BufferRPE于离心柱内，8000g离心2min，弃滤液。将miReasyMini柱转移到新的1.5mLEP管内。于柱内加入40μLDEPC水，室温12000g离心1min，得到的RNA溶液用于进一步实验。每组实验重复3次。

Trizol抽提法提取总RNA

向1×107个Hep2细胞中加入1mL Trizol抽提裂解液，充分混匀，室温静置5min，加入200μL氯仿剧烈震荡15s，静置2min；4℃12000g离心15min，取上清500μL，并在上清中加入500μL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。4℃12000g离心10min，弃上清。加入1mL75%的DEPC-乙醇，洗涤沉淀。4℃8000g离心5min，弃上清，可见白色RNA沉淀，滤纸吸干沉淀物，40μLDEPC水溶解RNA沉淀，RNA溶液用于进一步实验。每组实验重复3次。

RNA浓度及质量检测

使用Nanodrop2000超微量分光光度计测定总RNA的浓度、RNA纯度由OD260/280，OD260/230进行判读，具体如下：Nanodrop2000用2μLDEPC水调准基线，取2μL不同方法提取的总RNA溶液，读取RNA浓度，OD260/280及260/230比值，比值在1.8~2.0范围内证明RNA纯度高，达到下一步实验的要求。